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單細胞多組學技術

2020-07-03點擊17次
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從技術的角度看,隨著單細胞測序技術的發展,其研究范圍不再局限于轉錄組,而是擴展到了基因組、免疫組、表觀組、蛋白組等多組學水平,研究對象涉及染色質、DNA、表觀、轉錄因子、組蛋白、細胞表面蛋白等多種分子信息?;趩渭毎嘟M學數據,細胞聚類既可以通過來自相似細胞群的參考數據集中現有的細胞類型注釋對細胞進行聚類,也可以執行無監督聚類來識別相似細胞組,并利用其它分子層面數據來進行的更精細的劃分。

例如轉錄組數據可用于鑒定不同細胞類型或狀態之間差異表達的基因,基因組數據能夠在單細胞水平檢測基因拷貝數變化、單堿基突變、插入缺失及等信息,染色質可及性數據可用于鑒定可及區域和富集的 DNA 基序,表觀組數據可用于鑒定不同細胞類型或狀態之間的差異甲基化區域,蛋白質組數據可用于了解細胞間相互作用等。此外,近年來新出現的空間轉錄組測序方法及其數據整合算法,提供了細胞的空間信息,為單細胞測序技術進行了補充。

而從應用角度看,在腫瘤發生等復雜的生物過程中,異質性同時存在于基因組、轉錄組、表觀組、免疫組等多層面,基因相同的腫瘤細胞可能具有不同的 DNA 甲基化、基因表達、克隆擴增模式,因此常常需要多組學技術才能更加準確地將它們分類為不同亞群,揭示更深層的生物學機制。

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圖 4-5 多組學數據整合下的細胞聚類與注釋

(Tim et al. Nature reviews genetics 2018)

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圖 4-6 單細胞測序技術擴展到多組學和多分子水平

單細胞免疫組測序

免疫組庫是指在特定時間段內,機體所有有功能的 T 細胞和 B 細胞的總和。人體的適應性免疫系統主要依靠于 T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞表面的 T 細胞受體(TCR) 和 B 細胞受體(BCR),其受體上的互補決定區(CDR) 與 MHC- 抗原肽分子進行識別并特異性結合。BCR/TCR 存在一塊區域叫作互補決定區(CDR), 由 CDR1、CDR2、CDR3 組成,CDR1 和 CDR2 都是由 V 基因編碼,而 CDR3 是由 V、D、J 三個基因編碼形成,所以 CDR3 多樣性程度最高,是主要參與抗原識別的區域。

免疫組庫測序(Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)) 是以 T/B 淋巴細胞為研究目標,通過多重 PCR 或 5’RACE 技術特異性擴增決定 B 淋巴細胞受體(BCR) 或 T 淋巴細胞受體(TCR) 多樣性的互補決定區(CDR3 區),再結合高通量測序技術,全面評估免疫系統的多樣性,深入挖掘免疫組庫與疾病的關系。免疫組庫測序技術應用非常廣泛,目前已經在腫瘤預后評價、白血病微小殘留病變監測、自身免疫性疾病診斷和疾病生物標志物開發等方面取得了一定的進展。

單細胞免疫組庫測序是在免疫組庫測序加入單細胞分選技術,在單細胞水平進行的免疫組庫測序,可在免疫組庫測序提供的信息基礎上,揭示細胞的免疫異質性信息,更加全面、深入地揭示腫瘤、疾病中的免疫機制。


單細胞蛋白質組學

盡管單細胞基因組和轉錄組能夠揭示單細胞水平的 DNA 和 RNA 結構,但是在細胞內主要發揮功能的成分是蛋白質,因而研究單細胞蛋白質組學成為新興領域。單個細胞中蛋白質的總量通常小于 1ng,比用于常規蛋白質組分析的量至少減少 100  倍,而且數以千計的蛋白質具有高度的動態范圍和化學計量,因而單細胞蛋白質組學目前還存在諸多難點,技術仍處于早期發展階段。前文介紹的質譜流式技術和其他流式技術都是目前已有的重要的單細胞蛋白組學技術。

目前,單細胞蛋白組學技術主要對細胞表面蛋白的檢測,通過類似于流式細胞術的表面抗體標記技術,將細胞的免疫表型與轉錄組學得到的細胞群相匹配。不同于流式細胞術的熒光標記抗體,單細胞表型的蛋白質組學使用寡核苷酸耦合的抗體,從而不受限于熒光通道和熒光補償,可以在單細胞表面標記上百種甚至上千種蛋白,從而顯著提高了基于流式細胞術和質譜流式的單細胞蛋白質組的通量。

主流的單細胞蛋白質組的檢測有 BD 公司的 AbSeq 和 Biolgend 公司的 TotalSeq。

BD 公司的 AbSeq 平臺,結合 BD 公司的 Rhapsody,將單細胞表面標記和測序相結合,基于細胞表面的標記的 Hashtag 抗體,能夠對不同樣品來源的細胞進行 barcode 標記,提高通量、降低成本。此外如 4.2 章所述,有自身對應的轉錄組和免疫組的后續流程。同為 Rhapsody 系統,使用的蜂巢板技術是依靠細胞重力自由沉降,避免了 10x Genomics 中存在的碰撞,所以對于起始細胞活性要求較低。此外,BDTMAbSeq 抗體 - 寡核苷酸復合物利用寡核苷酸測序來獲得多重蛋白檢測,用于單細胞水平的多組學分析,使得研究者可以在同一實驗中同時檢測蛋白質(抗體 - 抗原相互作用分析)和 mRNA 表達。BD 多樣本分析試劑盒,同樣利用抗體偶聯樣本標簽(寡核苷酸序列)對不同來源樣本進行標記,然后混樣進行檢測,可以顯著降低時間成本和實驗成本(最多可實現 12 個樣本的同時檢測),還可以通過樣本標簽識別多細胞數據,提高單細胞數據質量。

Biolgend 的 TotalSeq 技術是目前應用最廣泛的單細胞蛋白質組方案。TotalSeq 無縫對接現有的單細胞 RNA 測序工作流程中,包括 Drop-Seq 和 10x Genomics 提供的工作流程,如 Cellranger 等,使數據分析效率顯著提高。同時提供三類不同的寡核苷酸偶聯抗體:TotalSeqA, B, C,分別對應 10x Genomics 的單細胞轉錄組和免疫組的應用?,F有的表面標記抗體超過一千種,能夠對單細胞的免疫表型進行全面解讀。同時開發 cell-hashing 的技術,使用 hashtag 抗體對不同樣本進行標記,從而在后續分析中通過去卷積的方法獲得對應樣品的數據信息,顯著提高輸入樣品的通量和實驗成本。此外,Biolegend 提供預制混合好的凍干的抗體組合,使用方便且通量提高。

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